Sekvenovanie DNA
SEKVENOVANIE DNA je určenie poradia nukleotidov, teda primárnej štruktúry DNA
MAXAMOVA-GILBETOVA CHEMICKÁ METÓDA
Vychádza sa z úseku dsDNA, ktorý je 5´konci rádioaktívne značený rádioaktívnym fosforom ( γ – 32P ) pomocou enzýmu polynukleotidkinázou.
V 4 paralelných skúmavkách sa jeden z nukleotidov ( napr. C v prvej, A v druhej, atď. ) metyluje, čiže sa naň naväzuje CH3 skupina.
dATP dTTP dGTP mCTP
dATP dTTP mGTP dCTP
dATP mTTP dGTP dCTP
mATP dTTP dGTP dCTP
Následne sa reťazce DNA v metylovaných miestach špecificky lámu a každý vzniknutý fragment získa rádioaktívne značený 5´koniec, čo určí presnú pozíciu metylovaného nukleotidu v každej vzorke.
Po elektorforetickej separácii fragmentov značeného templátu DNA a rádiografii sa sekvencie DNA čítajú v smere zdola nahor.
Nevýhodou tejto metódy je práca s rádioaktívne značeným 32P, ktoého polčas rozpadu je veľmi krátky – iba 14 dní.
SANGEROVÁ TERMINAČNÁ METÓDA
Sangerova metóda využíva 1-vláknový templát DNA, na ktorého 5´koniec je špecificky naviazaný primer.
Využíva sa DNA polymeráza I. viazaná na Klenow fragment, ktorá syntetizuje komplementárne vlákno ku templátovej DNA.
V 4 paralelných skúmavkách sa teda nachádza 1-vláknový templát DNA, pričom v každej skúmavke sa jeden z nukleotidov nachádza vo forme dideoxyribonukleotidu ( to zn., že nemá na 3´konci voľnú OH skupinu, takže sa nemôže inkorporovať do narastajúceho reťazca ).
dATP dTTP dGTP ddCTP
dATP dTTP ddGTP dCTP
dATP ddTTP dGTP dCTP
ddATP dTTP dGTP dCTP
V mieste takto značeného nukleotidu sa syntéza končí, takže vznikajú rôzne dlhé fragmenty s rovakým naviazaným primerom a rovnakým dideoxyribonukleotidovým koncom.
Po elektorforetickej separácii fragmentov značeného templátu DNA a autorádiografii sa sekvencie DNA čítajú v smere zdola nahor.
AUTOMATICKÉ SEKVENOVANIE DNA
Jedná sa o modernú metódu sekvenovania DNA, ktorá vychádza zo Sangarovej enzymatickej metódy.
Detekcia produktov je viazaná na použitie fluorescenčných farbív.
V 4 kapilárach sa nachádzajú identické templáty DNA, pričom každý z nukleotidov je zafarbený iným farbivom.
dATP dTTP dGTP dCTP
dATP dTTP dGTP dCTP
dATP dTTP dGTP dCTP
dATP dTTP dGTP dCTP
Každé farbivo má vlastnú vlnovú dĺžku, takže signál uvoľnený farbivom pri kapilárnej elektroforéze v tekutom polymére prechádza cez čip, ktorý pomocou lasera vyhodnotí absorbanciu jednotlivých farbív.
