Imunologické metódy
Imunologické metódy:
§ Interakcia protilátok a anitgénov
§ Antigén – analyzovaný proteín
§ Prtilátky môžu byt:
ü Primárne
ü Sekundárne naviazané s enzýmom (alkalická fosfatáza, chrenová peroxidáza), komerčne dostupné
§
Antigén + primárna protilátka
tvorba komlexu protilátka-antigén naviazanie sekundárnej protilátky + substrát detekcia komplexu
§ Patria sem:
1. Afinitná chromatografia:
§ Protilátky sú kovalentne naviazané k matrixu (napr. agaróza)
§ Aplikujeme proteínovú vzorku, naviaže sa na vzroku (väzba protilátka-antigén)
§ Potom môžeme vyeulovať antigén elučným roztokom
2. Imunoprecipitácia:
§ Pozostáva z toho, že proteíny sa rádioaktívne označia, pridajú sa protilátky, aplikuje sa na SDS
§ Izolácia komplexu pomocou afinitnej chromatografie, vyeluuje sa komplex
§ Detekcia
§ Postup:
1. proteíny sú rádioaktívne značené (AMK)
2. vytvrnie komlexu antigén – portilátka
3. izolácia komplexu
4. afinitná chromatografia – proteíny A/G viažu sa k protilátkam
5. SDS – PAGE
6. detekcia
3. Imunofluorescencia (IFA):
§ Postup:
1. Lokalizácia proteínu v špecifických bunkách
2. Komplex antigén-protilátka (primárna a sekundárna protilátka)
3. Sekundárna protilátka je konjugovaná s fluorochromom (fluoresceín, rodamín) – červená a zelená fluorescencia
4. Detekcia fluorescenčným mikroskopom
4. Wester blotting:
§ Je rýchla a citlivá metóda na detzekciu a charkterizáciu bielkovín
§ Umožnuje overiť funkčnosť inkorporovaného transgénu na úrovni bielkoviny
§ Postup:
1. Proteíny sú elektroforeticky separované v polyakrylamidovom gély za denaturujúcich podmienok SDS – PAGE a následne prenesené na nitrocelulózovú membránu
2. Tvorba komplexu – na membráne sa naviažu najprv primárne protilátky, na ne vhodné proteíny a až potom sa naviažu sekundárne protilátky
3. Ako špecifická próba sa využívajú monoklonálne protilátky proti hľadanému protínu
4. Inkubácia membrány so substrátom – farebná precipitácia na membráne – detekcia prítomnosti analyzovaého proteínu
§ Ak je primárna protilátka pripravená v králikoch, sekundárna protilátka sa pripravuje napríklad v koze proti králičím imunoglobulínom, sekundárne protilátky sú komerčne dostupné
5. ELISA:
§ Kvantifikačná metóda
§ V mikroplatničkách
§ Kvantifikácia proteínu
§ Postup:
1. Antigén (proteín) – purifikovaný proteín, hrubý proteínový extrakt (vzroka) aplikujeme vzroku proteínu a potom:
2. Primárne protilátka
3. Sekundárne protilátky – sú konjugoané s enzýmom (alkalická fosfatáza, chranová peroxidáza) komerčne dostupné
4. Chromogenický substrát
5. Detekcia – intenzita farebenej reakcie – spektrofotometricky (ELISA reader)
