Baktérie

SPOSOBY PRENOSU DNA DO BAKTERIÁLNEJ BUNKY: TRANSFORMÁCIA, KONJUGÁCIA, TRANSFEKCIA A TRANSDUKCIA

 

Baktérie sa nedajú krížiť ako plne sexuálne eukaryotické organizmy, a preto sa prenos rekombinantnej DNA do ich buniek uskutočňuje pomocou tzv. REKOMBINAČNÝCH PROCESOV, medzi ktoré patrí:

  • Transformácia ( pomocou plazmidových vektorov )
  • Transfekcia ( pomocou vírusov a fágov )
  • Transdukcia ( pomocou fágov a cháronov )
  • Konjugácia ( pomocou kontaktu medzi baktériami )

Najpoužívanejšími procesmi sú transformácia a transdukcia.

Spoločné charakteristiky rekombinačných procesov:

  • Rekombinanty obyčajne vznikajú len pri malom % prítomných buniek, špecifickými podmienkami sa počet rekombinantov môže zvýšiť
  • Prenos génu je jednosmerný, z donorových buniek do recipientných
  • Dočasne vznikajúce zygoty sú diploidné pre časť preneseného genetického materiálu, tzv. MEROZYGOTY
  • Rekombinačné procesy sa podarilo realizovať len u niektorých typoch baktérií

( napr. Bacillus subtilis, Staphylococcus aurens )

 

TRANSFORMÁCIA

Je genetická modifikácia vyvolaná inkorporáciou purifikovanej bunkovej alebo vírusovej DNA.

Je to prenos GI pomocou DNA uvoľnenej z buniek donorového kmeňa. Pri tomto procese dochádza k dedičným zmenám recipientnej bunky vnesením rDNA cez bunkovú membránu.

Aby došlo ku transformácii, musia byť bunky v určitom fyziologickom stave, tzv. KOMPETENCII BUNIEK, je to vlastne stav, v ktorom sú bunky schopné adsorbovať a pohlcovať transformačnú DNA. Vznik kompetencie súvisí s prítomnosťou špecifickej bielkoviny = FAKTORA KOMPETENCIE F, ktorý pôsobí spolu so svojím receptorom na bunkovej stene.

Faktor F aktivuje syntézu bielkovín súvisiacich s kompetenciou – autolyzínu, DNA väzobnej bielkoviny a endonukleáz bunkovej steny. Receptory adsorbujú dsDNA k povrchu bunky, endonukleáza rozdelí dsDNA fragmenty na ssDNA, ktoré prejdú do vnútra bunky s rýchlosťou prechodu 55 nukleotidov sa sekundu. SsDNA fragmenty sa v bunke spájajú s DNA väzobnou bielkovinou, pričom donorové fragmenty vytesňujú homologické reťazce príjemcu.

Úspešnosť transformácie závisí od týchto faktorov:

·        Kompetencia buniek – schopnosť buniek adsorbovať a pohlcovať rDNA, pričom bunky prijímajú veľké množstvo CaCl2 a vylučujú Mg2+, čo má za následok dočasné porušenie bunkovej membrány

·        Optimálna veľkosť rDNA – minimálna Mr je 105

·        Počet transformantov ( bunky s rDNA ) je priamo úmerná koncentrácii rDNA, ale existuje aj stav nasýtenia, po ktorom koncentrácia klesá

·        Prídavok iného typu DNA ( plazmidová DNA, fágy ) znižuje úspešnosť transformácie

 

TRANSFEKCIA je zvláštnym prípadom transformácie, pri ktorom sa prenáša fágová alebo vírusová infekcia na komptentnú recipientnú bunku pomocou DNA izolovanej z virulentného fágu alebo vírusu.

 

KONJUGÁCIA

Je to parasexuálny prenos genetického materiálu, ktorý vyžaduje priamy kontakt medzi živou donorovou ♂ bunkou a recipientnou ♀  bakteriálnou bunkou. Pri kontakte sa bunky spájajú pomocou spojovacieho kanálika ( pillus ), cez ktorý prechádza chromozóm donorovej bunky do recipientnej bunky.

Donorové bunky majú fertilitný faktor F+, správajú sa ako ♂ bunky. Recipientné bunky majú faktor fertility F- a správajú sa ako ♀ bunky. Po konjugácii je recipientná bunka počas niekoľkých generácii diploidná pre časť preneseného chromozómu a označuje sa ako MEROZYGOTA.

TRANSDUKCIA

Je to rekombinačný proces, pri ktorom sa prenáša časť bakteriálneho chromozómu prostredníctvom fága.

Podľa virulencie sa fágy delia na:

  1. VIRULENTNÉ FÁGY

Vyvolávajú úplnú lýzu buniek, a to 6 fázami:

    • Adsorpcia fága na povrch bunky pomocou bičíkových vlákien
    • Otvorenie bunkovej steny lyzozýmom v hexagonálnej doštičke
    • Injikovanie DNA fága pomocou fágového bičíka
    • Zastavenie syntézy bakteriálnych bielkovín
    • Zahájenie syntézy bielkovín za kontroly génov vírusových fágov
    • Lýza bunky, uvoľnenie fágov do prostredia
  1. TEMPEROVANÉ ( MIERNE ) FÁGY

Môžu viesť k lýze bunky analogicky ako fágy virulentné, môžu však prejsť aj do stavu profága ( stav lyzogénie ), to zn., že sa integrujú do bakteriálneho chromozómu a synchrónne sa s ním rozmnožovať. Počas tohto procesu sa potláča syntéza vírusových bielkovín.

Temperovaný fág je pri transdukcii  ako sprostredkovateľ, ktorý prenáša z donorového kmeňa do recipientnej bunky malé úseky bakteriálneho chromozómu.

Existujú 3 typy transdukcie:

·        Nešpecifická transdukcia

Transdukujúci fág prenáša recipientný gén alebo gény z ľubovoľnej oblasti chromozómu donorovej bunky .

·        Špecifická transdukcia

Transdukujúci fág môže prenášať gén len z určitej oblasti chromozómu donora do recipientnej bunky

·        Abortívna transdukcia

Nemusí nastať rekombinácia prenesenej časti, a tým nevzniká trvalý rekombinant. Vnesený chromozómový úsek v cytoplazme recipienta môže pretrvávať a ovplyvňovať jeho fenotyp, po rozdelení prechádza fragment len do 1 dcérskej bunky, a tým sa z kultúry vytesňuje.

FOREX