Klonovanie

Molekulové klonovanie:

  • klonovanie DNA, klonovanie génov
  • umožňuje rozmnoženie jednej molekuly DNA na ľubovoľný počet molekúl
  • klonovanie DNA je používanie len niekoľkých metód z množstva technik   rDNA

 

·        DNA z donorovej bunky, ktorá obsahuje špecifický gén sa poštiepi pomocou reštrikčných endonukleáz

·        Fragmenty NA (transgén) sa včlenia so kruhovej molekuly DNA nazývanej vektor čím vznikne rekombinantná molekula rDNA

·        Včlenený fragment  - inzert

·        Vektor vykonáva funkciu trasportnej jednotky, ktorá prenesie inzert do hostiteľskej bunky – hovoríme o transformácii bunky

·        V hostiteľskej bunke sa vektor replikuje, čím sa vytváraj mnohonásobné kópie inzertu

·        Hostiteľská bunka sa delí pričom  sa rDNA prenáša na jej potomstvo, takže nastáva ďalšia mnohonásobná replikácia inzertu, po dostatočnom počte bunkových delení vznikne klon identických hostiteľských buniek, z ktorých každá obsahuje kópie rekombinantnej molekuly DNA – molekulový klon

Technika klonovania:

§         Generácia vysokého počtu kópií DNA (napr. rekombinantnej DNA) pomocou replikácie v hostiteľskom organizme

§         Vyvinuté v 70. rokoch

§         Môže produkovať neobmedzené množstvo kópí génu

§         Aplikácie:

ü      Genetické mapovanie

ü      Sekvenácia DNA

ü      Mutačné analýzy

ü      Transformácia

ü      Genetické inžinierstvo

ü      PCR

ü      Reštrikčné analýzy

ü      Knižnice rekombinantných DNA

ü      Transkripčné analýzy

 

Klonovanie DNA:

§      Cieľom je generovanie veľkých množstiev čistej DNA, s ktorou sa ľahko manipuluje/analyzuje

§      Kroky klonovania:

1.      izolácia DNA z organizmu (napr. extrakciou)

2.      enzymatické štiepenie DNA na vhodnú veľkosť

3.      vložiť každý kúsok (fragment) DNA do klonovacieho vektora, teda vytvorenie rekombinantnej molekuly

               Klonovací vektor = umelá molekula DNA, ktorá sa replikuje 

               v hostiteľskom organizme (napr. v baktériách)

4.      transformácia rekombinantnej DNA (klonovací vektor + DNA fragment) do hostiteľa, v ktorom sa bude množiť a prenášať prenesené kópie do potomstva

Techniky rekombinantných DNA:

  • súbor pracovných postupov (metodík), ktoré sú potrebné na prípravu, analýzu a transfor-máciu rekombinantných DNA
  • patria tu aj techniky ako napr. PCR, sekvenovanie, hybridizácia NK a ďalšie

Základné etapy prípravy rDNA:

  • izolácia DNA (vektorová a donorová)
  • príprava rekombinantnej DNA
  • selekcia rekombínantov
  • analýza rekombinantov
  • prenos rDNA do recipientnej bunky (transformácia)

Izolácia DNA:

  • Izolácia plazmidovej DNA (baktérie)
  • Izolácia chromozómovej (genomickej) DNA (eukaryoty, prokaryoty)
  • Izolácia mRNA a prepis do cDNA (eukaryoty)