Reštrično-modifikačné systémy

R-M (reštrikčno -  modifikáčné) - systémy obsahujú:

 

Ø      Reštrikčné endonukleázy – (RE) sú enzýmy, ktoré rozpoznávajú špecifické nukleotidové sekvencie na dvojvláknovej DNA a štiepia jej oba vlákna v rozpoznávacej sekvencii alebo mimo nej

Ø      Modifikačné metylázy – enzýmy, kt. rozpoznávajú tú istú sekvenciu  ako rečtrikčné endonukleázy, modifikujú ju metyláciou, v dôsledku čoho ju RE nerozoznávajú a neštiepia

 

Modifikácia ( metylácia):

ü      nemá vplyv na transkripciu, ani na priebeh a vplyv replikácie DNA  a preto nie   je dedičná, avšak schopnosť modifikovať vlastnú DNA je genetický daná.

                Zdroj CH3 :    S   – adenozylmetionín

                                        Adenín  - N6  metyladenín

                                        Cytozín –C5  – metylcytozín

ü      zdroj RE – baktérie Haemophylus influenzae

ü      rozpoznávané sekvencie RE   4 - 8 bp dlhé sekvencie nukleotidov, väčšinou palindromické

 

Nomenklatúra R-M- systémov:

  1. Rodový a druhový názov hostiteľskej organizmus, je identifikovaný prvým písmenom a dvoma písmenami druhu E.coli       Eco
  2. Nasleduje označenie kmeňa alebo typ daného organizmu (napr. E.coli, kmeň B = Eco B)
  3. Ak má hostiteľský kmeň viac R-M systémov, tie sa označujú  rímskymi číslicami......Hind II =  Haemophylus influenzae, kmeň d, enzým druhý.
  4. Rozdelenie R-M systémov:

·        Sú to enzýmy, ktoré rozpoznávajú špecifické nukleotidové sekvencie na 2-vláknovej DNA a štiepia jej obe vlákna v rozpoznávacej sekvencii a alebo mimo nej. Nachádzajú sa najmä u baktérií, najlepším zdrojom je Heamophylus influenzae.

·        Sú súčasťou tzv. RESTRIKČNO-MODIFIKAČNÝCH SYSTÉMOV baktérií, kde plní dôležitú úlohu pri ochrane bakteriálnych buniek pri vstupe cudzorodej DNA do nich. Aby RE nezničili vlastnú bakteriálnu bunku, baktérie majú ej tzv. metylázy, teda enzýmy, ktoré rozpoznávajú tú istú sekvenciu ako RE a modifikujú ju metyláciou tak, že ju RE nerozoznávajú a neštiepia.

1. TRIEDA:

  • Vykazujú endonukleázovú aj metylázovú aktivitu. Štiepia náhodne. Rozoznávajú metylovanú sekvenciu nukleotidov, putujú od nej pozdĺž DNA na vzdialenosť 1 000 – 5 000 nukleotidov, kde štiepia.
  • Napr. Eco B s rozoznávacou sekvenciou TGA(N8)TGCT, Eco K
  • Môžu vzniknúť rôzne dlhé fragmenty s rôznymi koncami
  • Vyžadujú ATP, horčík, S - adenozylmetionín

2. TRIEDA:

  • Vykazujú endonukleázovú, resp. metylázovú aktivitu. Štiepia v rozpoznávacej špecifickej sekvencii, ktorá je rotačne symetrická, teda obsahuje palindromatické sekvencie.
  • Molekula DNA sa štiepi a rozoznáva v palindróme
  • Využívajú sa na získavanie fragmentov DNA, ale iba v prípade, ak gén nemá intróny a vieme, že sa na danom mieste dá štiepiť, čo je u eukaryotov zložité
  • Vyžadujú pre restriktázy iba horčíkové ióny a pre metylázy S – adenozylmetionín

a)      Typ I.:

v     Štiepi vlákno DNA tak, že vznikajú prečnievajúce 1-vláknové lepivé úseky na 5´konci vzniknutých fragmentov.

v     Napr. EcoRI

              

5´- GAATTC – 3´                              5´- AATTC.....G – 3´

3´- CTTAAG – 5´                                        3´- G.....CTTAA – 5´

                         

b)      Typ II.:

v     Štiepi vlákno DNA tak, že vznikajú prečnievajúce 1-vláknové lepivé úseky na 3´konci vzniknutých fragmentov.

v     Napr. Pst I., Hhi I.

                    

5´- GCGC – 3´                                   5´- C.....GCG – 3´

3´- CGCG – 5´                            3´ - GCG.....C – 5´

             

c)      Typ III.:

v     Štiepia vlákno DNA tak, že vznikajú fragmenty so zarovnanými tupými koncami

v     Napr. Hal III., Eco RV.

                

5´- CGCG – 3´                                   5´- CG.....CG – 3´

3´- GCGC – 5´                                   3´- GC.....GC – 5´          

3. TRIEDA:

·        Je to multifunkčný enzým zložený z 2 odlišných podjednotiek a vykazuje endonukleázovú aj metylázovú aktivitu

·        Enzýmy štiepia 24 – 26 bp ku 3´- koncu od rozpoznávacieho miesta, pričom vznikajú presahujúce 1-vláknové konce nešpecifickej sekvencie

·        Predstaviteľom je endonukleáza Hga I., ktorá rozpoznáva sekvenciu  GACGC ( N )5 CTGCG ( N )10

N znamená ľubovoľné nukleotidy a číselný index ich počet