Vektory

 

VEKTORY POUŽÍVANÉ PRE MOLEKULOVÉ KLONOVANE PRI BAKTÉRIÁCH, KVASINKÁCH, VÍRUSOCH, RASTLINÁCH A ŽIVOČÍCHOCH

 

§      Vektor (prenášač) je molekula DNA, ktorá sa samostatne replikuje, rekombinuje s inou molekulou, začleňuje sa spolu s cudzorodým génom do genómu hostiteľa alebo sa replikuje nezávisle od genómu hostitela

§      Vektory DNA sa v genetickom inžinierstve používajú na prenos cudzorodých génov do organizmov a na klonovanie génov (vytváranie mnohopočetných kópií)

§      Typy klonovacích vektorov:

ü    Plazmidové

ü    Vírusové

ü    Vektory pre špeciálne účely (kombinácia plazmidov a vírusov upraveného chromozómu baktérií a kvasiniek)

Ø      Vlastnosti vektorov pre genetické manipulácie:

1.      Optimálna veľkosť: 106 – 108 Da

2.      Selekčný marker ( Ampr, Tetr ): gény, ktoré sa prejavia v hostiteľskej bunke a na základe ktorých je možné plazmid v bunke identifikovať

3.      Jedinečné klonovacie miesta pre RE: miesta, do ktorých je možné gén inkorporovať

4.      Mnohopočetné klonovacie miesta ( POLYLINKRE ): miesta štiepené veľkým množstvom nukleáz

5.      Klonovacia kapacita: 16 kb

6.      Schopnosť replikovať sa nezávisle od replikácie chromozómov hostiteľskej bunky

v     Kyvadlové (shutlle), bifunkčné vektory:

ü      Vektor obsahuje dva začiatky replikácie, čo im umožnuje replikovať sa v bunkách dvoch organizmov

ü      Napríklad v baktériách aj kvasinkách (iniciačné miesta replikácie v baktériách sú sekvencie ori a v kavasinkách ARS – autonómne sa replikujúce sekvencie)

ü      Plazmidové vektory nasúce bakteriofágové promótor v blízkosti klonovacích miest (T3, T7, SP)

ü      Umožnujú po ich linearizácie transkribovať cudzorodý gén in vito, alebo ich použiť ako hybridizačné sondy

v     Expresné vektory:

ü      Používajú sa na expresiu cudzorodého génu a reguláciu tvorba jeho produktu (optimálna produkcia bielkoviny, regulácia expresie génu)

ü      Obsahujú silný promótor umiestnený proti smeru transkripcie od klonovacieho miesta

v     Ko-integrálne vektory:

ü      Boli pri pravené ako prvé

ü      Na jednom plazmide majú ori a vir oblasť spolu s LB a RB sekvenciami (25 bp dlhé hraničné sekvencie ohraničujúce T-DNA oblasť Ti-plazmidu), medzi ktoré s umiestnujú rastlinné expresné kazety

v     Binárne vektory:

ü      Pozostávajú z dvoch plazmidov, prvý je odzbrojený Ti plazmid, ktorý má odstránenú T-DNA oblasť spolu s RB a LB skevenciami, ale zachované vir a ori oblasti

ü      Druhý je menší vektor obsahujúci LB a RB sekvencie, medzi ktoré s umiestňujú rastlinné expresné jednotky, tento menší vektor má ori oblasť, ktorá mu umožňuje replikovať sa nezávisle

ü      T-DNA oblasť binárneho vektora musí obsahovať:

§        Viacnásobné klonovacie miesto MCS – unikátne miesto štiepenia reštrikčnými endonukleázami

§        Selekčný markervý gén

§        Reportérový gén alebo cielený gén

ü      Všetky jednotlivé kroky prípravy binárneho vektora (klonovanie) sa uskutočnujú v E. coli. Po finálnej úprave binárneho vektora sa tento vektor prenesie do A. tumefaciens a to priamo elektoporáciou (pomocou elektrických impulzov) alebo nepriamo konjugáciou, pomocou Ti plazmidu, ktorý zabezpečí prenos binárneho vektora do A. tumefaciens pretože samotný binárny vektor nie je schopný priamej konjugácie               

 

VEKTORY sú zväčša kruhové, 2-vláknové molekuly DNA, schopné vlastnej reprodukcie, ktoré sa v molekulovom klonovaní používajú na prenos génov medzi rôznymi organizmami.

Typy klonovacích vektorov:

  • Vírusové: bakteriofág λ, bakteriofág M13, SVGT 5
  • Plazmidové: bakteriálny plazmid
  • Vektory vytvorené pre špeciálne účely ( kombinácie plazmidov a vírusov ): kyvadlové, expresné

REKOMBINANTNÁ MOLEKULA je teda zložená z 2 rozličných DNA:

  • DNA vektora
  • DNA génu

IZOLÁCIA VEKTOROV

Je založená na separácii zmesi lineárnej a kruhovej DNA.

1.      CHROMATOGRAFICKY na stĺpci hydroxyapatitu

2.      ULTRAODSTREĎOVANÍM v odstredivke

3.      ELEKTROFORÉZOU

4.      HYBRIDIZÁCIOU NK

 

FOREX