PRINCÍP MAPOVANIA GENÓMU
PRINCÍP MAPOVANIA GENÓMU
¢ Vytvorenie krátkych úlomkov DNA.
¢ Zmnoženie krátkych úlomkov DNA pomocou vektora.
¢ Určenie poradia nukleotidov v každom úlomku DNA.
¢ Zoradenie úlomkov DNA.
¢ Určenie poradia nukleotidov DNA celého genómu.
Genetické mapovanie je zobrazenie génov, alebo iných molekulárnych či fyzikálnych charakteristík v nukleových kyselinách.
Genómová mapa zobrazuje usporiadanie génov alebo iných markerov a vzdialenosti medzi nimi v každom chromozóme.
Mapovanie genómu je popis genómu pomocou:
orientačných bodov v genóme (krátke poradia nukleotidov DNA, regulačné miesta, gény),
presným poradím nukleotidov genómu (sekvenovanie genómu).
Mapovania genómu vyžaduje:
vytvorenie bodov zlomu a úlomkov DNA a označenie úlomkov DNA stabilnými informatívnymi znakmi.
Genómové mapy majú rôznu úroveň rozlíšenia, závislú na frekvencii bodov zlomu (priemerná veľkosť úlomkov) a hustote informatívnych znakov DNA.
ROZDELENIE GENÓMOVÝCH MÁP PODĽA ROZLÍŠENIA
- Mapy malého rozlíšenia:
majú menej bodov zlomu a informatívnych znakov. (cytogenetické mapy, genetické mapy, mapy s malou dávkou radiácie).
- Mapy stredného rozlíšenia:
majú viac bodov zlomu a informatívnych znakov (klony YAC, mapy s vysokou dávkou radiácie.
- Mapy veľkého rozlíšenia:
majú veľa bodov zlomu a informatívnych znakov (klony BAC, plazmidy (PAC), vírusy (P1), kozmidy).
- Mapy úplného rozlíšenia poradia báz v genóme:
sekvenčné mapy.
• Genómové mapy môžeme ďalej rozdeliť na:
– genetické - väzbové mapy
– reálne mapy.
• Genetické väzbové mapy znázorňujú relatívne umiestnenie génov alebo špecifických DNA markerov v chromozóme; môžu znázorňovať kódujúce oblasti (gény), fenotypové vlastnosti a molekulové markery.
• Reálne (fyzické) mapy znázorňujú chemické vlastnosti molekuly DNA. Sú založené na skutočnej vzdialenosti génov.
• Pri mapovaní rozsiahlych genómov je prvým stupňom vytvorenie väzbovej mapy niekoľkých tisícok genetických markerov umiestnených rovnomerne v chromozómoch. Poradie markerov na takejto mape a ich relatívne vzdialenosti sú založené na rekombinantných frekvenciách.
• Marker je akákoľvek fyzikálna alebo molekulárna charakteristika ktorou sa jedinci dajú rozlíšiť. Najpoužívanejším typom markerov pre tvorbu genetických máp sú mikrosatelity (mikrosatelitné mapy).
• Vo fyzickej mape sú vzdialenosti medzi markermi vyjadrené väčšinou počtom nukleotidov v DNA. Pre mapovanie celých genómov sú fyzické mapy vytvárané štiepením DNA každého chromozómu do mnohých rozlíšiteľných reštrikčných fragmentov a následným určením pôvodného poradia fragmentov v chromozómovej DNA.
• Je potrebné vytvoriť fragmenty, ktoré sa prekrývajú, a potom použiť sondu alebo automatické sekvenovanie koncových nukleodtidov, aby sa našlo prekrytie.
• Potrebné DNA fragmenty používané pre fyzické mapovanie sú pripravené klonovaním.
• Pri práci s rozsiahlymi genómami sa musí zopakovať viacero kôl štiepení, klonovaní a fyzického mapovania DNA.
• Prvý klonovací vektor je často umelý chromozóm kvasiniek (YAC), ktorý môže niesť vložené fragmenty dlhé milión bp alebo umelý bakteriálny chromozóm (BAC), ktorý môže niesť vložené úseky s veľkosťou 100000 až 500000 bp.
Sekvenovanie DNA
Úplná nukleotidová sekvencia genómu predstavuje konečnú mapu. Je to technológia klonovania fragmentov DNA, ktorá umožňuje sekvenovanie veľmi dlhých úsekov DNA molekúl v genómoch.
