Zvieratá
Génové konštrukty:
- V zásade fragmenty DNA, napr. chemicky syntetizovaná DNA, klonovaná DNA, alebo aj fragmenty chromozómov, sa môžu aplikovať a perspektívne integrovať do hostiteľského genómu v rôznom množstve a frekvencii.
- Súčasne je tu aj možnosť kontroly využívania výsledného produktu.
- Detekciu integrácie a expresie cudzorodých génov možno robiť špecifickými metódami na rôznej úrovni.
- Ich podstatou je izolácia a spracovanie DNA získanej z tkanív a krvi, bez ohľadu na štádium vývoja (embryo) alebo vek zvierat.
Vertikálny prenos génov :
- Prenos génov sa deje vertikálnym spôsobom od rodiča na potomstvo, a kombinujú sa všetky gény určitého genómu, hospodársky zaujímavé ale i nepriaznivé, ktoré sa musia po viac generácií selekciou z populácií vyradiť.
- Organizmus príjme genetický material od rodičov, prípadne genetickú informáciu v rámci druhu
TMGT :
- testis-mediated gene transfer – prenos genetickej informácie do gonád (semenníkov), následne 7 dní párenie, odber ejakuláta, inseminácia
- ich efektívnosť je v konečnej fáze veľmi nízka
- doteraz sa uskutočňoval pomocou retrovirálnych vektorov – lipozómov
SMGT:
- Sperm Mediated Gene Trans prenos rDNA nalepenej na povrchu spermií do vnútra oocytov
- + REMI – reštrikčným enzýmom sprostredkovaný prenos – integrácia
- + elektroporácia (elektroporácia DNA do spermií pred SMGT
- + mAB (protilátkou sprostredkovaný prenos), využíva sa špecifická monoklonálna protilátka
Všeobecne sa prenos génov u živočíchov rozdeľuje:
· prenos génov do gonád - TMGT
· prenos génov do gamét:
§ u oocytov je málo úspešná, DNA degraduje;
§ u spermatozoidov základom pre sprotredkovanie prenosu cudzích génov cez spermie je ich kokultivácia s cudzou DNA v suspenzii minimálne 30 minút pred in vitro oplodnením.
§ Na zvýšenie úspešnosti integrácie cudzej DNA v spermiách sa používajú lipozómy alebo elektroporácia.
§ Táto technika je len v experimentálnych rovinách, ale predpokladá sa jej vysoká úspešnosť.
· prenos génov do embrya:
§ uskutočnuje sa 4 môžnými spôsobmi:
A) mikroinjekcia cudzorodej DNA do prvojadra oplodneného vajíčka:
§ najviac rozpracovaná a používaná metóda, spočíva v mikroinjekcii malého množstva cudzej DNA (200 – 400 kópií), pripravenej v roztoku o známej koncentrácii, do prvojadra oplodneného vajíčka, najčastejšie do samčieho.
§ Vajíčko je z jednej strany fixované pomocou fixačnej pipety (holder) a z druhej strany injektované pomocou mikroinjekčnej ihly o veľkosti niekoľkých mikrometrov.
§ Vajíčka sú následne kultivované v podmienkach in vitro a po určitom čase selektované (na základe vývoja) a prenášané do vajcovodu, resp. maternice hormonálne pripravených recipientiek.
§ Faktory možného poškodenia vajíčka počas mikroinjekcie – vibrácie, dizajn pipety, technika operátora.
B) mikroinjekcia cudzorodej DNA do obidvoch provojadier oplodneného vajíčka
C) použitie retrovírusov resp. adenovírusov ako nosičov na prenos cudzej DNA:
§ Vhodným štádiom embrya pre využitie tejto metódy je 1-, 2-, 4- bunkové štádium, vo vyšších štádiách dochádza ku mozaicizmu, teda nedochádza k integrácii cudzorodej DNA do všetkých buniek embrya.
§ Ako vektory su používané defektné vírusy na báze retrovírusov a lebo adenovírusov, do ktorých je vložená požadovaná génová konštrukcia.
§ Limitujúcim faktorom tejto metódy je dĺžka génovej konštrukcie, ktorá by mala byť do 10 kb.
§ Infekcia spočíva v mikroinjekcii upravených vírusov pod zónu pellucidu alebo v kokultivácii embryí zbavených zóny pellucidy s tkanivovými kultúrami, ktoré nesú vírusy.
D) použitie embryonálnych kmeňových buniek:
§ EKB sú izolované z vnútornej bunkovej masy (inner cell mass – ICM) embrya v štádiu blastocysty. Vyznačujú sa schopnosťou nediferenciácie počas kultivácie v niekoľkých generáciách a navyše s dobrou schopnosťou kolonizovať embryo.
§ EKB môžu byť uprevené
§ Mikroinjekciou cudzou DNA ešte v in vitro,
§ Cudzia DNA je do nich zabudovaná vápenato-fosfátovou precipitáciou.
o Následne sú bunky kultivované a selektované pomocou selekčných markerov (napr. neo gén), ktoré sú súčasťou génovej konštrukcie. Takto upravené a vyselektované EKB sú použité na prenos selekcie transgénnych kmeňových buniek a inzercia génu na špecifickémiesto chromozómu pomocou homologickej rekombinácie
· GMO – organizmus, ktorého genetický materiál bol zmenený spôsobom, ktorý sa prirodzene pri pohlavnom rozmnožovaní a prirodzenej rekombinácii nevyskytuje
· Obsahuje:
ü Transgén – minimálne 1 gén, DNA, génová konštrukcia navyše
ü Knock – out – minimálne 1 gén pôvodný, vyblokovaný (aby nefungoval)
Konck – in – modifikovaný pôvodný gén (modifikujeme gén aby fungoval)
Aspirácia:
· odobratie (napr. aspirácia spermií zo semenníkov a pre potreby IVF)
· mikroaspirácia jednej blastoméry = pomocou špecifických mikromanipulačných jednotiek vyberieme z embrya len jednu blastoméru. Na realizáciu tejto metódy postačuje embryo v štádiu 8-16 blastomér alebo moruly (používa sa pri určovaní pohlavia embrya)
Maturácia oocytov :
- dozrievanie nezrelých oocytov mimo tela donorky v špeciálnom médiu a CO2 inkubátore
In vitro oplodnenie:
- medzi v súčasnosti používané metódy umelého oplodnenia patria IVF (in vitro fertilizácia) s kapacitovanými spermiami, subzonálna injektáž spermie do perivitelného priestoru a intracytoplazmatická injektáž spermie do ooplazmy oocytu (ICSI).
a) Pri metóde intracytoplazmatickej injektáže spermie ide o priame vloženie spermie do cytoplazmy vajíčka. Embryológ vyberie spermiu, ktorá sa javí ako zdravá a zachytí ju do ultra tenučkej injekčnej ihly a odstráni bičík spermie. Oocyt sa potom špeciálnou pipetou pridrží a ihlou sa doň vloží spermia. Následne sa ihla mimoriadne opatrne vyberie. Celý proces netrvá dlhšie ako 1-2 minúty. Následný postup je identický s IVF metódou.
b) Pri technike subzomálnej injektáže spermie do perivitelného priestoru zavádzame niekoľko spermií do perivitelného priestoru, pričom jedna z nich oocyt oplodní. Táto metóda nie je veľmi úspešná, pretože sa u nej často vyskytuje polyspermia.
Tvorba n-ploidných embryí:
- tvorba gynogénnych, androgénnych jedincov a polyploidov
A) Pri tvorbe androgénneho jedinca mikromanipulačným zásahom dosiahneme stav, kedy vajíčko nesie genetickú výbavu len po otcovi a kedy namiesto samičieho prvojadra budú vo vajíčku dve samčie prvojadrá.
B) Ak samčie prvojadro nahradíme samičím, vajíčko bude vybavené gentickou informáciou po matke, obidve prvojadrá budú samičie a vtedy sa jedná o vytvorenie gynogénneho jedinca.
C) Triploid – vajíčko sa po oplodnení ošetrí cytochalasínom B, čím sa dosiahne zablokovanie cytokinézy (oddelenie dcérskych buniek po mitóze) v samičom prvojadre, v dôsledku čoho nedochádza k vypudeniu druhého pólového telieska s polovičným počtom chromozómov. Samičie prvojadro tak získa 2n počet chromozómov a v samčom prvojadre obsah chromozómov zostáva bez zmeny čiže n.
D) Tetraploid – získa sa elektrofúziou dvoch buniek (blastomér) jedného embrya v 2-bunkovom štádiu, kde každá blastoméra ma diploidný počet chromozómov.
Partenogenéza:
§ produkcia embryí využitím len materského genetického materiálu, bez prítomnosti samčej pohlavnej bunky (spermie).
§ Mechanizmus spočíva v stimulácii samičej gaméty, znížením aktivity MFP (maturation promotor faktor – faktor zodpovedný za dozrievanie vajíčka) rôznimy induktormi
§ Výsledkom môže byť:
ü Vajíčko obsahujúce prvojadro s haploidným počtom chromozómov a s druhým pólovým telieskom
ü Predelené vajíčko s dvomi bunkami (blastomérami), pričom každá obsahuje haploidný počet chromozómov v jadre
ü Vajíčko obsahujúce prvojadro s diploidným počtom chromozómov, bez druhého pólového telieska
§ Faktory ktorými možno aktivovať oocyt rozdelujeme na dve skupiny:
A) in vivo – elektrický šok, anestéza, tepelný šok
B) in vitro – elektrický šok, tepelný šok, enzymatické ošetrenie, chemické ošetrenie a hypertonické alebo hypotonické podmienky
Chimerizácia:
§ Chimerické embryo (jedinec), je indivídium, ktoré pozostáva z viac než jednej geneticky odlišnej populácie buniek pochádzajúcich z viac než jednej zygoty. Je to teda organizmus pozostávajúci z dvoch alebo viacerých geneticky rozdielnych rodičovských párov.
§ Fenotypovým prejavom môže byť mozaiková participácia populácií buniek v rôznych tkanivách od pigmentácie kože a srsti cez orgány v tele v rozdielnom prcentuálnom zastúpení, i keď vo všeobecnosti je tendencia na rovnovážny pomer.
Tvorba chimérických embryí:
· agregáciou buniek:
ü Dve embryá sú enzymaticky zbavené zony pellucidy a následne sú kultivované in vitro v kvapke média v tesnej blízkosti. Počas vývoja dochádza k agregácii (zoskupeniu) blastomér oboch embryí s následnou kompaktizáciou.
ü Výsledkom je participácia obidvoch populácií buniek na tvorbe vnútornej bunkovej masy (ICM), čiže embryonálnych kmeňových buniek (základ vyvíjajúceho sa plodu) a trofoblastu (základ plodových obalov).
· prostredníctvom prenosu buniek:
ü Prenos jednej alebo niekoľkých buniek jednej populácie z prvého embrya do hostiteľského embrya (druhá populácia buniek).
ü Najideálnejšie vývojové štádia buniek vykazujú embryonálne bunky vnútornej bunkovej masy (vývojové štádiá embryí nemusia byť rovnaké).
ü Tieto bunky sú schopné určitej tolerancie počas in vitro kultivácie a po ich prenose do hostiteľského embrya, najčastejšie do blastocysty, sú schopné participovať na tvorbe nového jedinca (percentuálne menej). Táto metóda sa používa pri tvorbe GMO cez EKB.
· pomocou kokultivácie (coculture):
ü Opätovná kultivácia embryí zbavených zony pellucida ako hostiteľských buniek v suspenzii EKB v petriho miske (in vitro). EKB sú od seba oddelené enzymaticky tak, aby boli uvoľnené a môžu agregovať s prítomnými embryami.
· metódou „sandwich“:
ü Agregácia sa uskutočňuje v médiu, v špeciálnych jamkách, kde na dno je umiestnené embryo bez zona pellucida, na to naložíme zhluk GM EKB a opäť embryo bez zona pellucida. Vytvopríme tzv, sandwich buniek, ktoré spolu agregujú.
Tvorba transgénnych embryí:
v Pri tvorbe transgénnych jedincov ide o vnášanie cudzej DNA (pripravenej génovej konštrukcie) do genómu jedinca. Transgénny jedinec je charakteristický tým, že má vo svojom genóme zabudovaný (integrovaný) cudzí gén s následnou expresiou (fenotypovým prejavom) a schopnosťou prenášať tento gén na potomstvo.
v Génové konštrukcie používané pre tvorbu transgénnych jedincov môžu obsahovať:
· Celé gény – samotná sekvencia DNA spolu s regulačnými sekvenciam,
· Minigény – intróny alebo exóny sú vyradené z funkcie,
· Hybridné gény – promótor spojený s kódujúcou sekvenciou iného pôvodu spolu s polyadenylačným signálom.
v Všeobecne sa prenos génov u živočíchov rozdeľuje:
· prenos génov do gonád - TMGT
· prenos génov do gamét:
§ u oocytov je málo úspešná, DNA degraduje;
§ u spermatozoidov základom pre sprotredkovanie prenosu cudzích génov cez spermie je ich kokultivácia s cudzou DNA v suspenzii minimálne 30 minút pred in vitro oplodnením.
§ Na zvýšenie úspešnosti integrácie cudzej DNA v spermiách sa používajú lipozómy alebo elektroporácia.
§ Táto technika je len v experimentálnych rovinách, ale predpokladá sa jej vysoká úspešnosť.
· prenos génov do embrya:
§ uskutočnuje sa 4 môžnými spôsobmi:
A) mikroinjekcia cudzorodej DNA do prvojadra oplodneného vajíčka:
§ najviac rozpracovaná a používaná metóda, spočíva v mikroinjekcii malého množstva cudzej DNA (200 – 400 kópií), pripravenej v roztoku o známej koncentrácii, do prvojadra oplodneného vajíčka, najčastejšie do samčieho.
§ Vajíčko je z jednej strany fixované pomocou fixačnej pipety (holder) a z druhej strany injektované pomocou mikroinjekčnej ihly o veľkosti niekoľkých mikrometrov.
§ Vajíčka sú následne kultivované v podmienkach in vitro a po určitom čase selektované (na základe vývoja) a prenášané do vajcovodu, resp. maternice hormonálne pripravených recipientiek.
§ Faktory možného poškodenia vajíčka počas mikroinjekcie – vibrácie, dizajn pipety, technika operátora.
B) mikroinjekcia cudzorodej DNA do obidvoch provojadier oplodneného vajíčka
C) použitie retrovírusov resp. adenovírusov ako nosičov na prenos cudzej DNA:
¨ Vhodným štádiom embrya pre využitie tejto metódy je 1-, 2-, 4- bunkové štádium, vo vyšších štádiách dochádza ku mozaicizmu, teda nedochádza k integrácii cudzorodej DNA do všetkých buniek embrya.
¨ Ako vektory su používané defektné vírusy na báze retrovírusov a lebo adenovírusov, do ktorých je vložená požadovaná génová konštrukcia.
¨ Limitujúcim faktorom tejto metódy je dĺžka génovej konštrukcie, ktorá by mala byť do 10 kb.
¨ Infekcia spočíva v mikroinjekcii upravených vírusov pod zónu pellucidu alebo v kokultivácii embryí zbavených zóny pellucidy s tkanivovými kultúrami, ktoré nesú vírusy.
D) použitie embryonálnych kmeňových buniek:
§ EKB sú izolované z vnútornej bunkovej masy (inner cell mass – ICM) embrya v štádiu blastocysty. Vyznačujú sa schopnosťou nediferenciácie počas kultivácie v niekoľkých generáciách a navyše s dobrou schopnosťou kolonizovať embryo.
§ EKB môžu byť uprevené
§ Mikroinjekciou cudzou DNA ešte v in vitro,
§ Cudzia DNA je do nich zabudovaná vápenato-fosfátovou precipitáciou.
o Následne sú bunky kultivované a selektované pomocou selekčných markerov (napr. neo gén), ktoré sú súčasťou génovej konštrukcie. Takto upravené a vyselektované EKB sú použité na prenos selekcie transgénnych kmeňových buniek a inzercia génu na špecifickémiesto chromozómu pomocou homologickej rekombinácie
Klonovanie:
- tvorba geneticky identických jedincov (teoreticky)
- Tvorba klonov:
· Bisekciou:
ü Rozdelenie embrya na dve polovice v štádiu moruly resp. blastocysty pomocou mikronoža. Po prenose do recipientiek sa narodia geneticky identické jedince, ktorých genetická výbava pochádza od obidvoch rodičov.
· Prenosom jadier embryonálnych buniek:
ü Prenášajú sa jadrá včasných embryí (blastoméry) do enukleovaného oocytu, mechanicky zbaveného samičieho genetického materiálu
ü Výhodou je, že z jedného takéhoto embrya máme k dispozícii 32 blastomér, z ktorých možno teoreticky získať 32 geneticky identických klonov, tieto majú GI tiež od oboch rodičov.
· Prenosom jadier somatických buniek:
ü Spôsob tvorby klonovaných jedincov je rovnaký ako v predchádzajúcej technike s tým rozdielom, že do enukleovaného oocytu prenášame somatickú bunku (po jej kultivácii a synchronizácii jadra), čiže v porovnaní s embryonálnou bunkou je somatická bunka diferencovaná a tak jej GI musí byť reprogramovaná.
ü Narodené jedince sú navzájom geneticky identické, ako aj s rodičom, z ktorého boli somatické bunky izolované.
· Technikou HMC (“handmade cloning”):
ü V princípe ide o bisekciu časti oocytu, pričom oddelíme metafázovú platničku II s pólovým telieskom.
ü Zvyšok DNA je použitý na fúziu so somatickou bunkou s jadrom, následne realizujeme aktiváciu fúzovaného jadra.
Hybridné embryá - vytvárajú sa vložením jadra ľudskej bunky do zvieracieho vajíčka
