Plazmidy

 

– ICH CHARAKTERISTIKA, ROZDELENIE, VLASTNOSTI A VYUŽITIE

 

PLAZMIDY sa v procese molekulového klonovania používajú ako NOSIČE ( VEKTORY ) pre gény, ktoré chceme včleniť do genómu hostiteľskej bunky a ktoré by sa následne mali prejaviť požadovaným fenotypovým znakom.

REKOMBINANTNÁ MOLEKULA je teda zložená z 2 rozličných DNA:

  • DNA plazmidu
  • DNA génu

Plazmidy sa prirodzene nachádzajú len v baktériách, ale nie všetky sa dajú použiť ako vektory. Niektoré musia byť modifikované alebo umelo vytvorené.

 

PLAZMIDY

Sú to extrachromozomálne elementy, ktoré sa dokážu replikovať nezávisle od bakteriálneho chromozómu v cytoplazme buniek baktérií.

Štruktúra: kruhová 2-závitnica DNA

Veľkosť: 106-108

V bunkách baktérií sa môže nachádzať 1 alebo viac plazmidov rôznej veľkosti.

Nesú gény:

  • Potrebné pre ich vlastnú replikáciu v hostiteľskej bunke
  • Potrebné pre ich prenos v hostiteľskej bunke
  • Na tvorbu KOLICÍNOV ( bielkovín toxických pre hostiteľské bunky, ale nie pre produkujúcu bunku )
  • Vyvolávajúce rezistenciu na antibiotiká alebo ťažké kovy
  • Na produkciu antibiotík

Typy plazmidov:

a)      R-plazmidy ( Plazmidy rezistencie ): sú schopné podmieňovať v hostiteľských bunkách rezistenciu na antibiotiká alebo ťažké kovy

b)      Col ( kolicínové ) plazmidy: v bunke navodzujú tvorbu polypeptidových toxínov – kolicínov, bakteriocínov s rôznymi účinkami

c)      F-plazmidy ( Plazmidy fertility ): považujú sa za tzv. čisté plazmidy, pretože okrem replikačných a fertilitných génov neobsahujú takmer žiadne gény. Pre ich prenos je potrebný priamy kontakt medzi samčou a samičou  bunkou. Dokážu prenášať sami seba, čím sa nefertilné F- bunky menia na fertilné F+ bunky

d)      Virulentné plazmidy: spôsobujú patogenitu a virulenciu baktérie v hostiteľskej bunke. Napr. Ti plazmid baktérie Agrobacterium tumefaciens, ktorá indukuje tvorbu nádorových ochorení vyšších rastlín

e)      Degradatívne plazmidy: kódujú enzýmy zabezpečujúce rozklad neprirodzených molekúl ( toluén, kys. salicylová )

 

VLASTNOSTI PLAZMIDOV PRE GENETICKÉ MANIPULÁCIE

  1. Optimálna veľkosť: 106 – 108 Da
  2. Selekčný marker ( Ampr, Tetr ): gény, ktoré sa prejavia v hostiteľskej bunke a na základe ktorých je možné plazmid v bunke identifikovať
  3. Jedinečné klonovacie miesta pre RE: miesta, do ktorých je možné gén inkorporovať
  4. Mnohopočetné kllonovacie miesta ( POLYLINKRE ): miesta štiepené veľkým množstvom nukleáz
  5. Klonovacia kapacita: 16 kb
  6. Schopnosť replikovať sa nezávisle od replikácie chromozómov hostiteľskej bunky

 

IZOLÁCIA PLAZMIDOV

Je založená na separácii zmesi lineárnej a kruhovej DNA.

Na izoláciu plazmidov sa najčastejšie používa tepelný šok a následné ochladenie zmesi.

1.      CHROMATOGRAFICKY na stĺpci hydroxyapatitu

Plazmidová DNA sa viaže na hydroxyapatit, chromozomálna DNA nie. Elučným roztokom sa kruhová DNA uvoľňuje z komplexu tak, že sa zo stĺpca najprv uvoľní lineárna, až potom kruhová DNA

2.      ULTRAODSTREĎOVANÍM v odstredivke

Využíva hustotný gradient CsCl spolu s EtBr. Odstreďovanie prebieha 24 hodín pri 200 000 otáčkach za minútu.

EtBr spôsobí, že hustejšia plazmidová DNA sa usadí nižšie a redšia chromozomálna DNA vyššie v skúmavke.

Jednotlivé DNA sa injekčnou striekačkou prepipetujú do oddelených skúmaviek.

3.      ELEKTROFORÉZOU

DNA sa delia na základe ich rozličnej pohyblivosti na nosičoch:

·    Agarózový gél

·    Polyakrylamidový gél

4.      HYBRIDIZÁCIOU NK

Využíva sa rádioaktívne značená sonda a iódový izotop

 

Ti PLAZMID

Ti ( „tumor inducing“ ) plazmid sa v rastlinnom molekulovom klonovaní využíva najčastejšie.

Je to kruhová 2-vláknová molekula DNA o veľkosti 1,2 x 108 Da

Nachádza sa v pôdnych baktériách Agrobacterium tumefaciens a Agrobacterium rhizobium, nie je prirodzeným plazmidom rastlinných buniek.

Baktérie môžu infikovať 2-klíčnolistové rastlina a tvoriť hľuzky ( kalusy ), syntetizovať výživné lázky opíny pre ďalšie baktérie, hromadiť nádorové pletivá, ktoré rastú nediferencovane.

Plazmidy môžu byť:

  • OKTOPÍNOVÉ ( OCT ): nesú gény pre syntézu oktopínov
  • NOPALÍNOVÉ ( NOP ): nesú gény pre syntézu nopalínov

Oktopíny aj nopalíny sú deriváty AMK arginínu:

  • OCT = N-karboxy-ethyl-L-arginín
  • NOP = N-dikarboxy-propyl-L-arginín

Ti plazmid má 3 špecifické miesta:

  1. VIR OBLASŤ

Obsahuje gény zodpovedné za virulenciu = prenos T-DNA z Ti plazmidu do rastlinného genómu, ale aj prenos T-segmentu z bakteriálnej do rastlinnej bunky

  1.  TRA OBLASŤ

Nesie gény za konjugatívny prenos Ti plazmidu medzi bakteriálnymi bunkami

  1. T-SEGMENT, tzv. TRANSFORMAČNÁ DNA ( T-DNA )

Je to molekula veľká:

    • 14 – 24 kb pri oktopínoch
    • 23 – 24 kb pri nopalínoch

       Z plazmidu sa integruje do chromozómu rastlinnej bunky, pričom jej inkorporácia je

       náhodná.


       Má 3 oblasti:

a)      ľavá  a pravá hraničná sekvencia T-segmentu

b)      ONKOGÉNY, ktoré sú zodpovedné za tvorbu nádorov:

·        Shi ( shout inhibition ): inhibujúce tvorbu výhonkov

·        Roi ( rhout inhibition ): inhibujúce tvorbu koreňov

c)        Gény kódujúce syntézu:

·        Oktopínov – oktopínsyntetázu

·        Nopalínov – nopalínsyntetázu

 

RASTLINNÉ VÍRUSY: KAULIMOVÍRUSY, GEMINIVÍRUSY

Dajú sa využiť na prenášanie génov do rastliny. Jedná sa však o nestabilné gény, teda sa neprenášajú stabilne z generácie na generáciu.

Môžu to byť 1-vláknové ( geminivírusy ) alebo 2-vláknové ( kaulimovírusy ) molekuly DNA.

Najdôležitejšími sú vírusy CaMV ( vírus mozaiky karfiolu ), TGMV ( vírus zlatej mozaiky rajčiny )

 

 

 

FOREX