Anlýza rekombinantov

Ø      Metódy selekcie rekombinantnej DNA sú založené na identifikácii buniek, do ktorých bola rekombinantná DNA včlenená.

Ø      Sú založené na reakcii bunky vloženej do rôznych druhov prostredia, podľa toho, aký vektor sa použil na vnesenie génu do recipientnej bunky.

Ø      V ideálnom prípade nastane transkripcia a translácia cudzorodého génu a vzniknutý požadovaný produkt je dôkazom, že vnesená DNA sa do genómu zabudovala a že sa účinne replikuje, prepisuje a prekladá do bielkoviny.

Ø      Podľa reakcie bunky vnesenej do prostredia sa vyhodnocuje prítomnosť, resp. neprítomnosť vektora a cudzorodej DNA.

·        Genetická metóda – selekcia na základe tvorby antibiotikovej rezistencie pôvodného vektora

·        Imunochemická metóda – expresia preneseného génu, produkcia bielkoviny

·        Fyzikálno - chemická metóda – hybridizácia nukleových kyselín

1. GENETICKÁ METÓDA:

v     V plazmide pBR 322, ktorý nesie gény rezistencie na tetracyklín ( TET^r ) aj ampicilín ( AMP^r ), restriktáza BAMH1 štiepi gén TET^r , kde sa vloží cudzorodý úsek DNA, čím sa gén inaktivuje

v     Po ligácii a transformácii do E.coli sa bunky vysejú na agarové živné médium s AMP ako zdrojom energie. Vyrastú na ňom transformované aj netransformované bunky.

v     Vyrastené kolónie sa „prepečiatkujú“ na ďalšie živné médium, tento krát agar s tetracyklínom. Vyrastú na ňom len nerekombinované kolónie, keďže iba tie nesú gén pre rezistenciu na tetracyklín.

v     Porovnaním s prvou platňou môžeme identifikovať kolónie s rDNA.

2. IMUNOCHEMICKÁ METÓDA:

v     Založená je ne reakcii gén – antigén.

v     Transformované bunky sa vysejú na misku s agarom. Po prerastení sa kolónie „prepečiatkujú“ na ďalšiu misku a pôvodná kolónia sa usmrtí chloroformom alebo pôsobením bakteriofága.

v     Obsah buniek sa lýzou uvoľní do prostredia a spolu s ním aj produkt – bielkovina naklonovaného génu.

v     Krúžok tenkej polyvinylovej fólie s naviazanou protilátkou proti transformovanej bielkovine, ktorá má byť produktom naklonovaného génu, sa pretlačí na agar s lyzovanými kolóniami. Na protilátku sa špecificky naviaže len jej antigén ( bielkovina ).

v     Na polyvinylovú fóliu sa potom pôsobí roztokom tej istej protilátky, ale označenej rádioaktívnym jódom ( ¹²⁵I ). Značená protilátka sa viaže len na miesta, kde je už naviazaný antigén.

v     Tieto miesta sa ľahko identifikujú autorádiografiou a z pôvodnej repliky sa izoluje príslušná kolónia baktérií, ktoré obsahujú exprimovaný gén.

3. FYZIKÁLNO – CHEMICKÁ METÓDA:

v     Kolónie baktérií sa z misky agaru „prepečiatkujú“ na nitrocelulózový filter. Pôsobením alkálií nastane lýza buniek a denatrurácia uvoľnenej DNA.

v     Proteinázou sa DNA uvoľní z nukleoproteínového komplexu. Rozštiepená bielkovina sa zmyje z filtra. Nitrocelulóza sa naviaže na denaturovanú 1-vláknovú DNA.

v     ssDNA sa ukotví na filter zvýšením teploty na 80°C a filter sa ponorí do roztoku s rádioaktívne označenou sondou RNA

v     použije sa RNA, z ktorej sa  klonovaná sekvencia DNA odvodila reverznou transkriptázou. Vzniká tak hybrid RNA – rDNA.

v     Po premytí a vysušení sa filter nechá v kontakte s rontgenovým filmom. Miesto, kde nastala hybridizácia ssDNA sa sondou, sa identifikuje ako čierna bodka na filme.

v     Porovnaním s pôvodnou miskou možno izolovať kolónie baktérií, ktoré obsahujú klonovaný gén.

1.       Fyzikálna analýza rekombinantov - hybridizačné metódy (Southern, Northern, Western blotting):

Southern blot hybridizácia (Edward M. Souther):

• Metóda pomocou, ktorej dokazujeme nielen prítomnosť transgénu v genóme, ale aj počet kópií, prípadne ich usporiadanie

• Postup:

ü      Štiepenie DNA reštrikčnou endonukleázou

ü      Separácia DNA fragmentov elektroforézou v agarózovom géle

ü      Deneturácia separovanej DNA (roztok NaOH) a neutralizácia

ü      Prenos DNA (kapilárny alebo vákuom) na nilonovú alebo nitrocelulózovú membránu

ü      Fixácia DNA na membránu (UV alebo 80°C)

ü      Príprava hybridizačnej próby:

§      značenie rádioaktívne (³²P), nerádioaktívne (digixigenín, biotín)

§      Random priming – náhodné hexamérové oligonukleotidy sú pripojené k vláknam denaturovanej DNA (iniciačné miesto pre DNA polymerázuI – Klenow fragment) – Klenow fragment + dNTP (dCTP značený s ³²P alebo digixigenínom)

ü      Hybridizácia s denaturovanou rádioaktívne alebo nerádioaktívne zančenou próbou

ü      Naviazanie próby s komplementárnymi DNA sekvenciami – ds DNA

ü      Detekcia miesta kde došlo k naviazaniu próby, autorádiografiou, rádioaktívne značenie sa robí priamo X ray film a nerádioaktívne značenie sa robí – substrátom – enzymatickou reakciou a X ray film.

Northern blotting:

§         Detekcia prítomnosti špecifickej mRNA v celkovej RNA

§         Zisťujeme či inkorporovaný gén je transkripčne aktívny a či dochádza k tvorbe príslušnej mRNA

§         Postup:

ü      Izolácia celkovej RNA

ü      Elektroforéza v agarózovom géle za denaturujúcich podmienok (formaldehyd)

ü      Prenos RNA na membránu

ü      Fixácia RNA na membránu

ü      Príprava hybridizačnej próby (cDNA fragment)

ü      Hybridizácia s denarutovanou ³²P rádioaktívne značenou próbou

ü      Detekcia miesta kde došlo k naviazaniu próby – autorádiougrafiou

§         Využitie:

ü      Sledovanie expresiu génu v rôznom type pletiva, v ktorom období, či sa expresia mení vplyvom určitých podmienok

ü      Kvantifikácia prítomnej mRNA

ü      Či genomická DNA próba má oblasť, ktorá je transkribovaná

Wester blotting:

§         Je rýchla a citlivá metóda na detzekciu a charkterizáciu bielkovín

§         Umožnuje overiť funkčnosť inkorporovaného transgénu na úrovni bielkoviny

§         Postup:

1.      Proteíny sú elektroforeticky separované v polyakrylamidovom gély za denaturujúcich podmienok SDS – PAGE a následne prenesené na nitrocelulózovú membránu

2.      Tvorba komplexu – na membráne sa naviažu najprv primárne protilátky, na ne vhodné proteíny a až potom sa naviažu sekundárne protilátky

3.      Ako špecifická próba sa využívajú monoklonálne protilátky proti hľadanému protínu

4.      Inkubácia membrány so substrátom – farebná precipitácia na membráne – detekcia prítomnosti analyzovaného proteínu

§         Ak je primárna protilátka pripravená v králikoch, sekundárna protilátka sa pripravuje napríklad v koze proti králičím imunoglobulínom, sekundárne protilátky sú komerčne dostupné

FOREX