Génové inžinierstvo
GÉNOVÉ INŽINIERSTVO využíva metódy a techniky na prenos génov medzi rôznymi organizmami pri prekonávaní medzidruhovej bariéry.
Umožňuje:
- Kombinovať úseky DNA bez ohľadu na ich pôvod a takto spojené molekuly začleňovať do ľubovoľných organizmov
- Vytvárať organizmy s cudzorodými génmi s novými cielenými vlastnosťami
- Cielene vyradiť niektoré gény – tzv. „knock out“
• Klasická genetika:
- Ø prenos genetickej informácie metódami sexuálnej hybridizácie eukaryí
- Ø parasexuálne prenosy: konjugácia, transdukcia, transformácia prokaryí
• GI:
- Ø prenos úseku DNA medzi organizmami umelou transformáciou, transdukciou
- Ø zaistenie udržania expresie cudzorodých génov
• Klasická genetika:
- Ø prenos celého genómu
- Ø spontánna a indukovaná mutagenéza
- Ø selekcia na základe fenotypu
• GI:
- Ø prenos časti genómu, cielenej sekvencie
- Ø aplikácia mutagenézy a rekombinácie
- Ø selekčné techniky založené na využívaný sond
- Ø vyvolanie a udržanie zmien, ktoré nemôžu vzniknúť prirodzene
• Rozvoj techník GI podmienili objavy:
- Ø objavenie restrikčných endonukleáz, DNA-ligázy, reverznej transkriptázy
- Ø objavenie a vývoj klonovacích vektorov
- Ø rozvoj metód zavedenia rekombinantnej DNA do hostiteľskej bunky
- Ø vývoj selekčných metód na výber rekombinantnej DNA v hostiteľskej bunke
ENZÝMY NEVYHNUTNÉ PRE GÉNOVÉ INŽINIERSTVO
Sú to enzýmy, ktorých substrátom sú NK. Sú vysoko špecifické a schopné pracovať s veľmi malým množstvom substrátu.
Podľa substrátu ich delíme na:
- DNAázy
- RNAázy
Podľa reakcií, ktoré katalyzujú, sa delia na:
- Enzýmy syntetizujúce NK: Polymerázy
- Enzýmy modifikujúce NK: Fosfatázy, Metylázy, Kinázy
- Enzýmy spájajúce NK: Ligázy
- Enzýmy štiepiace ( odbúravajúce ) NK: Nukleázy
Najdôležitejšími sú reverzná transkriptáza, restrikčná endonukleáza a DNA ligáza.
RESTRIKČNÉ ENDONUKLEÁZY ( RE )
Sú to enzýmy, ktoré rozpoznávajú špecifické nukleotidové sekvencie na 2-vláknovej DNA a štiepia jej obe vlákna v rozpoznávacej sekvencii a alebo mimo nej. Nachádzajú sa najmä u baktérií, najlepším zdrojom je Heamophylus influenzae.
Sú súčas´tou tzv. RESTRIKČNO-MODIFIKAČNÝCH SYSTÉMOV baktérií, kde plní dôležitú úlohu pri ochrane bakteriálnych buniek pri vstupe cudzorodej DNA do nich. Aby RE nezničili vlastnú bakteriálnu bunku, baktérie majú ej tzv. metylázy, teda enzýmy, ktoré rozpoznávajú tú istú sekvenciu ako RE a modifikujú ju metyláciou tak, že ju RE nerozoznávajú a neštiepia.
Rozdelenie RE:
1. TRIEDA
Vykazujú endonukleázovú aj metylázovú aktivitu. Štiepia náhodne. Rozoznávajú metylovanú sekvenciu nukleotidov, putujú od nej pozdĺž DNA na vzdialenosť 1 000 – 5 000 nukleotidov, kde štiepia.
Napr. EcoB s rozoznávacou sekvenciou TGA(N8)TGCT
Môžu vzniknúť rôzne dlhé fragmenty s rôznymi koncami.
2. TRIEDA
Vykazujú endonukleázovú, resp. metylázovú aktivitu. Štiepia v rozpoznávacej špecifickej sekvencii, ktorá je rotačne symetrická, teda obsahuje palindromické sekvencie.
Molekula DNA sa štiepi a rozoznáva v palindróme.
Využívajú sa na získavanie fragmentov DNA, ale iba v prípade, ak gén nemá intróny a vieme, že sa na danom mieste dá štiepiť, čo je u eukaryotov zložité.
a) Typ I.
Štiepi vlákno DNA tak, že vznikajú prečnievajúce 1-vláknové lepivé úseky na 5´konci vzniknutých fragmentov.
Napr. EcoRI
↓
5´- GAATTC – 3´ 5´- AATTC.....G – 3´
3´- CTTAAG – 5´ 3´- G.....CTTAA – 5´
↑
b) Typ II.
Štiepi vlákno DNA tak, že vznikajú prečnievajúce 1-vláknové lepivé úseky na 3´konci vzniknutých fragmentov.
Napr. Pst I.
↓
5´- GCGC – 3´ 5´- C.....GCG – 3´
3´- CGCG – 5´ 3´ - GCG.....C – 5´
↑
c) Typ III.
Štiepia vlákno DNA tak, že vznikajú fragmenty so zarovnanými tupými koncami
Napr. Hal III.
↓
5´- CGCG – 3´ 5´- CG.....CG – 3´
3´- GCGC – 5´ 3´- GC.....GC – 5´
↑
3. TRIEDA
Je to multifunkčný enzým zložený z 2 odlišných podjednotiek a vykazuje endonukleázovú aj metylázovú aktivitu. Enzýmy štiepia 24 – 26 bp ku 3´- koncu od rozpoznávacieho miesta, pričom vznikajú presahujúce 1-vláknové konce nešpecifickej sekvencie.
Predstaviteľlom je endonukleáza Hga I., ktorá rozpoznáva sekvenciu GACGC ( N )5
CTGCG ( N )10
REVERZNÁ TRANSKRIPTÁZA ( RT )
Enzým, ktorý zabezpečuje syntézu DNA vlákna podľa vzoru molekuly RNA, ako aj syntézu druhého vlákna DNA komplementárneho ku 1-vláknovej molekule DNA.
Využíva sa pri syntéze, reps. získavaní fragmentov DNA v eukaryotických bunkách.
Procesom spätného prepisu GI z mRNA s exónovou štruktúrou vzniká kópiová alebo komplementárna cDNA.
T4 DNA LIGÁZA
Katalyzuje tvorbu fosfodiesterovej väzby medzi 5´- fosfátovou a 3´- OH skupinou susedných nukleotidov.
Používa sa ku vzájomnému spojeniu 2 molekúl DNA zakončených kohéznymi koncami.
Pri molekulách DNA s tupými koncami sa enzým využíva na pripojenie linkerov
( = syntetický 2-vláknový oligonukleotid, ktorý obsahuje rozpoznávaciu sekvenciu pre niektoré RE )
