Selekcia rekombinantov

SPOSOBY SELEKCIE REKOMBINANTNEJ MOLEKULY DNA V HOSTITEĽSKEJ BUNKE ( GENETICKÁ, IMUNOCHEMICKÁ, FYZIKÁLNOCHEMICKÁ )

Metódy selekcie rekombinantnej DNA sú založené na identifikácii buniek, do ktorých bola rekombinantná DNA včlenená.

Sú založené na reakcii bunky vloženej do rôznych druhov prostredia, podľa toho, aký vektor sa použil na vnesenie génu do recipientnej bunky.

V ideálnom prípade nastane transkripcia a translácia cudzorodého génu a vzniknutý požadovaný produkt je dôkazom, že vnesená DNA sa do genómu zabudovala a že sa účinne replikuje, prepisuje a prekladá do bielkoviny.

Podľa reakcie bunky vnesenej do prostredia sa vyhodnocuje prítomnosť, resp. neprítomnosť vektora a cudzorodej DNA.

• Genetická metóda je selekcia na základe straty antibiotikovej rezistencie pôvodného vektora
• Imunochemická metóda je založená na expresii preneseného génu a tvorbe antibiotík
• Fyzikálnochemická metóda je založená na hybridizácii molekúl NK pomocou sond

GENETICKÁ METÓDA

V plazmide pBR 322, ktorý nesie gény rezistencie na tetracyklín ( TET^r ) aj ampicilín

( AMP^r ) vyštiepi enzým restriktáza gén pre rezistenciu na tetracyklín. Na vyštiepené miesto sa vloží cudzí úsek DNA, čím sa gén inaktivuje.

Po ligácii a transformácii do E.coli sa bunky vysejú na agarové živné médium s AMP ako zdrojom energie. Vyrastú na ňom transformované aj netransformované bunky.

Vyrastené kolónie sa „prepečiatkujú“ na ďalšie živné médium, tento krát agar s tetracyklínom. Vyrastú na ňom len nerekombinované kolónie, keďže iba tie nesú gén pre rezistenciu na tetracyklín.

Porovnaním s prvou platňou môžeme identifikovať kolónie s rDNA.

IMUNOCHEMICKÁ METÓDA

Založená je ne reakcii gén – antigén.

Transformované bunky sa vysejú na misku s agarom. Po prerastení sa kolónie „prepečiatkujú“ na ďalšiu misku a pôvodná kolónia sa usmrtí chloroformom alebo pôsobením bakteriofága.

Obsah buniek sa lýzou uvoľní do prostredia a spolu s ním aj produkt – bielkovina naklonovaného génu.

Krúžok tenkej polyvinylovej fólie s naviazanou protilátkou proti transformovanej bielkovine sa pretlačí na agar s lyzovanými kolóniami. Na protilátku sa špecificky naviaže len jej antigén

( bielkovina ).

Na polyvinylovú platnu a potom pôsobí roztokom tej istej protilátky, ale označenej rádioaktívnym jódom ( ¹²⁵I ). Značená protilátka sa viaže len na miesta, kde je už naviazaný antigén.

Tieto miesta sa ľahko identifikujú autorádiografiou a z pôvodnej repliky sa izoluje príslušná kolónia baktérií, ktoré obsahujú exprimovaný gén.

FYZIKÁLNO – CHEMICKÁ METÓDA

Kolónie baktérií sa z misky agaru „prepečiatkujú“ na nitrocelulózový filter. Pôsobením alkálií nastane lýza buniek a denatrurácia uvoľnenej DNA.

Proteinázou sa DNA uvoľní z nukleoproteínového komplexu. Rozštiepená bielkovina sa zmyje z filtra. Nitrocelulóza sa naviaže na denaturovanú 1-vláknovú DNA.

SsDNA sa ukotví na filter zvýšením teploty na 80°C a filter sa ponorí do roztoku s rádioaktívne označenou sondou.

Po premytí a vysušení sa filter nechá v kontakte s rontgenovým filmom. Miesto, kde nastala hybridizácia ssDNA sa sondou, sa identifikuje ako čierna bodka na filme.

FOREX