Detekcia DNA, RNA
Vizualizácia naamplifikovanvch DNA fragmentov:
· Agarózové gély :
ü detekcia DNA fragmentov o veľkosti od desiatok až po tisícky bázových párov (bp) s rozlíšením väčším ako 3 bp
ü vizualizácia DNA pomocou fluorescenčného interkalačného činidla etídiumbromidu (EtBr), ktorý sa včleňuje medzi bázy DNA a pohybujú sa spolu s nimi
ü pri ultrafialovom svetle s vlnovou dĺžkou 254 nm fluorescencia EtBr označuje pozície molekúl DNA
· Polyakrylamidové gély:
ü identifikácia a separácia malých molekúl a fragmentov DNA (50-500 bp) s rozlíšením 1 bp
ü separácia sa uskutočňuje v elektródových tlmivých roztokoch pri vysokom napätí (2000-3000 V) prípadne pri vyššom konštantnom výkone (50 - 70 W) medzi elektródami
ü separované molekuly DNA sa vizualizujú v denaturovaných PAGE géloch pomocou dusičnanu strieborného, prípadne rádioaktívne alebo fluorescenčné
Metódy: Gélová elektroforéza:
§ Detekcia a analýza DNA, RNA
§ Typy gélov:
ü agarózový DNA (100 bp – 20 kb), RNA
ü polyakrylamidový DNA (5 – 1000 pb), RNA
§ molekuly (fosfárové skupiny negatívne nabité) sa pohybujú smerom k anóde podša molekulovej velkosit (menšie molkuly migrujú rýchlejšie)
§ Vizualizácia – pomocou farbičky, ktorá sa viaže na DNA alebo RNA (etídium bromid)
SDS – PAGE:
- Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel elektroforesis
- metóda používaná na separáciu protónov podľa molekulovej veľkosti
- polyakrylamidový gél – polymerizácia akrylamidu a bisakrylamidu v prítomnosti TEMEDU (NNNN tetramethylethylenediamine) katalyzuje polymerizáciu a amónium persulfátu – iniciuje polymerizáciu
- SDS – denaturuje proteíny – destabilizuje hydrofóbne väzby – primárna štruktúra a dáva negatívny náboj
- Merkaptoetanol – redukuje disilfidické väzby
Natívne polyakrylamidové gély:
o Proteíny sú separované v polyakrylamidovom géle (PAGE) za nedenaturujúcich podmienok – bez prítomosti SDS
o Separácia len na základe náboja proteínov – (pozitívne, negatívne, neutrálne)
o Nie je možné určiť Mw proteínov
o Detekcia enzymatickej aktivity proteínov
2D elektroforéza:
§ Postup:
ü Proteíny sú rozdelené v polyakrylamidovom géli s pH gradiendom (isoelektric focusing)
ü Pl = pH v ktorom má proteín nulový náboj
ü SDS –PAGE
ü analýza
