Klonovanie
Molekulové klonovanie:
- klonovanie DNA, klonovanie génov
- umožňuje rozmnoženie jednej molekuly DNA na ľubovoľný počet molekúl
- klonovanie DNA je používanie len niekoľkých metód z množstva technik rDNA
· DNA z donorovej bunky, ktorá obsahuje špecifický gén sa poštiepi pomocou reštrikčných endonukleáz
· Fragmenty NA (transgén) sa včlenia so kruhovej molekuly DNA nazývanej vektor čím vznikne rekombinantná molekula rDNA
· Včlenený fragment - inzert
· Vektor vykonáva funkciu trasportnej jednotky, ktorá prenesie inzert do hostiteľskej bunky – hovoríme o transformácii bunky
· V hostiteľskej bunke sa vektor replikuje, čím sa vytváraj mnohonásobné kópie inzertu
· Hostiteľská bunka sa delí pričom sa rDNA prenáša na jej potomstvo, takže nastáva ďalšia mnohonásobná replikácia inzertu, po dostatočnom počte bunkových delení vznikne klon identických hostiteľských buniek, z ktorých každá obsahuje kópie rekombinantnej molekuly DNA – molekulový klon
Technika klonovania:
§ Generácia vysokého počtu kópií DNA (napr. rekombinantnej DNA) pomocou replikácie v hostiteľskom organizme
§ Vyvinuté v 70. rokoch
§ Môže produkovať neobmedzené množstvo kópí génu
§ Aplikácie:
ü Genetické mapovanie
ü Sekvenácia DNA
ü Mutačné analýzy
ü Transformácia
ü Genetické inžinierstvo
ü PCR
ü Reštrikčné analýzy
ü Knižnice rekombinantných DNA
ü Transkripčné analýzy
Klonovanie DNA:
§ Cieľom je generovanie veľkých množstiev čistej DNA, s ktorou sa ľahko manipuluje/analyzuje
§ Kroky klonovania:
1. izolácia DNA z organizmu (napr. extrakciou)
2. enzymatické štiepenie DNA na vhodnú veľkosť
3. vložiť každý kúsok (fragment) DNA do klonovacieho vektora, teda vytvorenie rekombinantnej molekuly
Klonovací vektor = umelá molekula DNA, ktorá sa replikuje
v hostiteľskom organizme (napr. v baktériách)
4. transformácia rekombinantnej DNA (klonovací vektor + DNA fragment) do hostiteľa, v ktorom sa bude množiť a prenášať prenesené kópie do potomstva
Techniky rekombinantných DNA:
- súbor pracovných postupov (metodík), ktoré sú potrebné na prípravu, analýzu a transfor-máciu rekombinantných DNA
- patria tu aj techniky ako napr. PCR, sekvenovanie, hybridizácia NK a ďalšie
Základné etapy prípravy rDNA:
- izolácia DNA (vektorová a donorová)
- príprava rekombinantnej DNA
- selekcia rekombínantov
- analýza rekombinantov
- prenos rDNA do recipientnej bunky (transformácia)
Izolácia DNA:
- Izolácia plazmidovej DNA (baktérie)
- Izolácia chromozómovej (genomickej) DNA (eukaryoty, prokaryoty)
- Izolácia mRNA a prepis do cDNA (eukaryoty)
