Metylázy, ligázy, transferázy

Metylázy:

Ø      Modifikačné metylázy – enzýmy, kt. rozpoznávajú tú istú sekvenciu  ako rečtrikčné endonukleázy, modifikujú ju metyláciou, v dôsledku čoho ju RE nerozoznávajú a neštiepia

Modifikácia ( metylácia):

ü      nemá vplyv na transkripciu, ani na priebeh a vplyv replikácie DNA  a preto nie   je dedičná, avšak schopnosť modifikovať vlastnú DNA je genetický daná.

                Zdroj CH_{3 :}    S   – adenozylmetionín

                                        Adenín  - N_{6  –} metyladenín

                                        Cytozín –C₅  – metylcytozín

ü      zdroj RE – baktérie Haemophylus influenzae

ü      rozpoznávané sekvencie RE –   4 - 8 bp dlhé sekvencie nukleotidov, väčšinou palindromické

Ligázy a transferázy:

1. Terminálna transferáza: 

• zdroj  teľací týmus
• katalyzuje  reakcie  pridávaním d XTP na 3^/  koniec polynukleotidového vlákna
• VYUŽITIE – doplnenie komplementárného prečnievajúceho vlákna pri klonovaní do vektorov, pri tvorbe cDNA

2. T4 DNA ligáza:

• zdroj fág T4, E. coli
• katalyzuje vznik fosfodiesterovej väzby medzi  5^/ fosfátovou skupinou a 3^/ - OH skupinou susedného nukleotidu
• VYUŽITIE– pripojenie tzv. linkerov, spájanie kohéznych koncov DNA

3. T4 DNA polymeráza:

• zdroj: produkt génu 43 fága T4
• katalyzuje polymerizáciu deoxyribonukleotidov z 3^/ hydrogénového konca primeru naviazaného na 5^/ koniec Templátovej  DNA
• VYUŽITIE – zatupenie prečnievajúcich koncov pri cDNA

4. Klenov fragment:

• C – terminálna časť = E . coli DNA polymerázy I
• AKTIVITA -  5^/ - 3^/ polymerizačná , 3^/ - 5^/ exonukleázová
• polymeráza – menšia podjednotka – 5^/ - 3^/ exonukleázová aktivita

–        väčšia podjednotka = Klenov fragment – keď chceme len z 3^/ konca štiepiť

• VYUŽITIE – syntéza druhého vlákna c DNA, syntéza komplementárneho vlákna DNA, značenie DNA pomocou náhodných primerov

5. Taq polymeráza:

• zdroj – Thermofilus aquaticus
• Aktivita – 5^/- 3^/ polymerizačná a 5^/ - 3^/ exonukleázová, nemá 3^/ - 5^/ exonukleázovú aktivitu, teplotné optimum 75 – 80 ºC
• Využitie – PCR a jej aplikácie, sekvenovanie

1.       Nukleázy a ďalšie DNA modifikujúce enzýmy:

Nukleázy (DNázy, RNázy):

ü      štiepia fosfodiesterové väzby v DNA resp. RNA

v     podľa spôsobu štiepenia:

ü      endonukleázy – štiepia vo vnútri reťazca

ü      exonukleázy - štiepia od 5^/ alebo 3^/   konca reťazca

v     podľa špecifickej substrátu:

ü      DNázy resp. RNázy

ü      Štiepiace ssDNA resp. dsDNA

1. DNáza I:

• zdroj hovädzí pankreas
• exonukleáza vytvára na DNA jednoreťazové zlomy, pričom dochádza ku vzniku 5/ fofátových oligonukleotidov s veľkosťou  4-5 báz
• štiepi jednovláknovú aj dvojvláknovú molekulu DNA
• VYUŹITIE : degradácia DNA, purifikácia RNA, analýza proteínu : DNA interakcií(DNase footprinting)

2. Nukleáza Bal 31:

• zdroj Aeromonas espejiana BAC 31
• endonukleázová aktivita – štiepi jednovláknovú DNA
• exonukleázová aktivita – rovnomerne štiepi  obidva 3^/ a 5^/ konce dvojvláknovej molekuly DNA
• enzým pre svoju katalytickú aktivitu vyžaduje ióny Ca²⁺
• VYUŽITIE :  príprava delécii, tvorba, tuhých koncov, mapovanie pozadia reštrikčných miest

3. Ribonukleáza M:

• katalyzuje reakciu odštiepenia jednovláknových úsekov RNA- z hybridu DNA – RNA
• VYUŽITIE : mapovanie génov, odštiepovanie oligo (dT) alebo poly (dT) prečnievajúcich vlákien

4. Exonukleáza III:

• zdroj E.coli
• katalyzuje postupné odštiepovanie 5^/ prečnievajúcich alebo tupých koncov mononukleotidov z dvojvláknovej  molekuly DNA v smere 3^/          5^/, pričom  zanecháva 3^/- OH prečnievajúce konce
• VYUŽITIE : príprava jednovláknovej  DNA, mutagenéze in vitro

5. Nukleáza S1:

• zdroj Aspergilus oryzae
• prednostne štiepia jednovláknovú DNA alebo RNA, pričom otvára 5^/ -mono- a oligonukleotidy
• VYUŽITIE: odstraňovanie lepivých koncov, otváranie vlásočnicových očiek, analýza štruktúry DNA: RNA hybridov

6. Mung - Bean nukleáza:

• zdroj výhonku munga výhonku
• AKTIVITA– štiepi jednovláknovú RNA aj DNA

Fosfatázy:

1. Alkalycká fosfatáza:

§         zdroj E . coli, teľacie črevo

§         katalyzuje odštiepenie 5^/  fosfátovej skupiny a 3^/  fosfátovej skupiny z molekúl RNA a DNA

§         využitie – odstránenie koncovej fosfátovej  skupiny z molekúl RNA a DNA (sekvenovanie, hybridizácia).

2. Polynukleotid fosfatáza:

• zdroj Bakteriofág T4
• katalytuje polymerizačnúribonukleotiddifosfátov z anorg. Fosfátu
• VYUŽITIE – syntéza polyribonukleotidov a oligoribonukleotidov, syntéza rádio aktívne značených nukleotidov

3. T4 –polynukleotid kináza :

• zdroj – fág T4 a E. coli
• katalyzuje prenos fosfátu z molekuly ATP na 5^/ koniec molekuly DNA alebo RNA
• VYUŽITIE – sekvenovanie DNA, RNA

Reverzná transkriptáza:

• zdroj – živočíšne RNA vírusy
• zabezpečuje syntézu DNA vlákna podľa vzoru mRNA ako aj syntézu druhého vlákna DNA komplementárneho k jednovláknovej DNA
• VYUŽITIE– pri tvorbe cDNA 

FOREX