Rekombinantná rDNA

 

v     Postup tvorby rDNA:

Ø      Výber a príprava vhodného vektora (plazmid, baktriofág, kozmid, cháron, vírus)

Ø      Štiepenie vektora špecifickou RE – vznik kohéznych lepivých koncov

Ø      Izolácia donorovej DNA s požadovaným génom  a jeho príprava:

ü      Lepivé konce – štiepenie rovnakou RE ako vektor

ü      Tupé konce

ü      Pripojenie linkerov – štiepenie tou istou RE ako vektor a lepivé konce

ü      Pripojenie dXMP na 3 koniec terminálnou transferázou

Ø      Ligácia, spojenie donorovej DNA s vektorom:

ü      Spojenie donorovej DNA  a vektorovej DNA:

  1. lepivými koncami – vytvorením kovalentnej väzby T4 DNA ligázou (komplement Nbáz)
  2. tupímy koncami na donorovej DNA:
    • pripojením linkerov, štiepením RE a tvorbou kovalentnej väzby T4 DNA ligázou
    • pripojením dXMP na 3 koniec terminálnou transferázou (len pri klonovaní frgamentu cDNA)
    • ligácia – zmiešanie vektora inzertu, terminálneho roztoku, DNA ligázy pri teplote 8 – 20 ºC, Mg, ATP, 8 – 12 hodín (urýchlenie – polyetylénglykol, spermidín), optimum t = 4 ºC, čaqs 12 hodín

Získanie fragmentu DNA inzertu:

  1. DNA poštiepime vhodnou reštriktázou
  2. Poštiepená DNA sa rozdelí v agarózovom géli
  3. vhodný fragment sa z gélu vyreže a DNA sa vyextrahuje

Podmienky ligácie:

  • teplota 8 - 20°C, Mg2+, ATP, 8-12 hod.

Urýchlenie: polyetylénglykol, spermin, spermidín

v     Príprava kompetentných buniek E. coli:

1. Opracovanie s CaCl2:

  • Kultivácia buniek pri 4 ºC + Ca – zoslabenie bunkovej steny, dochádza k výmene Ca a Mg, ktoré sú v bunovej stene, vtedy sa uvolňujú Mg a Ca ešte nie sú naviazané, zoslabenie bunkovej steny, najbežnejšie používané

2.Heat shock transformácia:

  • transformácia 42 ºC 1 min – ľad, zvýšená teplota zvýši priepustnosť membrány
  • zahriatím na 42 ºC a následne ochladením dochádza k otvoreniu bunkovej steny

3.Elektroporácia:

  • kompetentné bunky sú vystavené pulzom vysokého napätia v dôsledku čoho vznikajú póry membráne

v     Prenos rDNA do E. coli:

v     Transformácia (plazmidové vektory)

v     Transfekcia (vírusové vektory)

v     Transdukcia (fágové vektory)

v     Konjugácia (medzi baktériami) – využíva sa najčastejšie

 

 

 

Spoločné charakteristiky rekombinačných procesov:

§         Rekombinanty obyčajne vznikajú len pri malom % prítomných buniek, špecifickými podmienkami sa počet rekombinantov môže zvýšiť

§         Prenos génu je jednosmerný, z donorových buniek do recipientných

§         Dočasne vznikajúce zygoty sú diploidné pre časť preneseného genetického materiálu, tzv. MEROZYGOTY

§         Rekombinačné procesy sa podarilo realizovať len u niektorých typoch baktérií

            (napr. Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus)

 

FOREX