Transformácia, Transkfekcia, Transdukcia, Konjugácia

1.Transformácia:

§      Proces kedy dochádza k dedičným zmenám recipientnej bunky vnesením pDNA cez bunkovú membránu

§      Úspešnosť transformácie:

ü      Kompletné bunky – schopnosť buniek absorbovať a pohlcovať rDNA (Ca faktor kompetencie F, autolyzín)

ü      Optimálna veľkosť rDNA (min. Mr = 10⁵)

ü      Počet transformantov = koncentrácia rDNA

§      Prídavok iného typu DNA (pDNA, lambda fágu = nižšia úspešnosť transformácie)

§      Príprava kompetentných buniek E. coli:

ü      Opracovanie s CaCl₂ – kultivácia buniek 4 ºC + Ca – zoslabenie bunkovej steny

ü      Heat shoch transformácia – teplota 42 ºC 1 minúta – ľad, vyššia teplota a priepustnosť membrány

§      Postup transformácie:

§         Absorbcia dsDNA na povrch bunky,  autolyzínom (alebo iným postupom) sa porušuje štruktúra vonkajšej bunkovej steny, ktorá je schopná pinocytózy

§         Endonukleáza – tvorí jednovláknové porušenia na dsDNA, degraduje 1 vlákno a ssDNA preniká do bunky (55 nukleotidov). V bunke sa ssDNA spája s DNA väzobnou bielkovinou, čím zníži svoju transformačnú aktivitu

§         ssDNA vytesňuje homologické reťazce recipientnej DNA, tvorenie heteroduplexov

§         reparačnou stabilizáciou dochádza k ich úplenj stabilizácii

2.Transfekcia:

§      Proces pri ktorom sa prenáša fágová alebo vírusová infekcia na kompetentnú recipientnú bunku pomocou NK kyseliny izolovanej z virulentného fágu alebo vírusu

3.Transdukcia:

§      Rekombinančný proces, pri ktorom sa prenáša časť bakteriálneho chromozómu prostredníctvom fága

§      Podľa virulencie sa fágy delia na:

§         Virulentné – vyvolávajú úplnú lýzu buniek (fágový lyzát):

v     Adsorbcia fága na povrch bunky pomocou bičíkových vlákien

v     Otvorenie bunkovej steny lyzozýmom (hexagonálna doštička)

v     Injikovanie DNA fága pomocou fágového bičíka

v     Zastavenie syntézy bakteriálnych bielkovín

v     Zahájenie syntézy bielkovín za kontroly génov vnesených fágom

v     Lýza bunky, uvolnenie fágov do prostredia

§         Temperované alebo mierne – môžu viest k lýze buniek analogicky ako virulentné fágy, môžu však prejsť aj do stavu profága (stav lyzogénie)

§      Typy transdukcií:

ü      Nešpecifická – fág môže preniesť na recipientnú kultúru gén alebo gény z ľubovoľnej oblasti chromozómu donorovej bunky

ü      Špecifická – fág môže prenášať gény len z určitej oblasti chromozómu donora

ü      Abortívna – nedôjde k rekombináciii, netvorí sa trvalý rekombinant, po rozdelení bunky prechádza fragment DNA len 1 z donorových buniek a tým sa z kultúry vyraďuje

4.Konjugácia:

FOREX