Génové knižnice
1. Tvorba genómových knižníc, konštrukcia genómových knižníc, cDNA banky:
Knižnice DNA:
ü Knižnice, v ktorých inzerty predstavujú fragmenty genómovej DNA daného organizmu sa nazývajú genómové knižnice.
ü Knižnice, obsahujúce DNA fragmenty, ktoré vznikli prepisom reverznou transkriptazou z mRNA daného organizmu sa nazývajú cDNA knižnice
ü Knižnice predstavujú „databázy“ genómov konkrétnych organizmov. Informácie z nich sa získavajú špecifickým prehľadávaním alebo tzv. skríningom knižníc.
ü Dĺžka fragmentov DNA, ktoré sa klonujú 20 - 30 kb
ü Klonovanie vo fágu alebo v kozmide.
Knižnice rekombinantných DNA (3 typy):
- Genómové knižnice, zbierka fragmentov genómovej DNA, obsahujúca aspon jednu kópu každej DNA sekvencie genómu (genóm je súhrn celkovej genetickej informácie organizmu)
- Chromozómové knižnice, zbierka fragmentov chromozómov
- Knižnice komplementárnych DNA (cDNA) fragmentov, zbierka DNA fragmentov, ktoré boli pripravené z mRNA buniek (napr. reverzn á transkriptáza (RNA závislá DNA polymeráza)
· Počet klonov kompletnej knižnice sa dá vypočítať z veľkosti genómu a z priemernej veľkosti (prekrývajúcich sa) fragmentov DNA
· Knižnica by mala obsahovať oveľa viac klonov ako je vypočítané minimálne množstvo
Používajú sa klonovacie vektory:
ü Plazmidové (menej ako 10 kb) – kolónie
ü Fág λ (37 – 52 kb) – plaky
ü Kozmidy (37 – 52 kb) – kolónie
ü Shuttle vektory – kolónie
ü Bakteriálne umelé chromozómy (BACs – menej ako 200 kb)
ü Kvasinkové umelé chromozómy (YACs – menej ako 500 kb)
Príprava genómovej knižnice:
§ Ľudský genom 3 x 109 bp
§ Knižnica humánnej genómovej DNA – potreba 150000 – 250000 klonov I fága na prekrytie celéo ludského genómu
§ Ak sa na tento účel použije plazmid je potreba získať 1 – 4 milióna plazmidových klonov na prekrytie celého udského genómu
§ Poznáme tri spôsoby prípravy knižníc:
- Úplný štiepením (na všetkých zodpovedajúcich reštrikčných miestach):
ü Vysoký počet krátkych fragmentov DNA
ü Gény môžu byť naklonované v niekoľkých kúskoch
- Mechanickým rozrušením (sharing):
ü Tvorba väčších fragmentov DNA
ü Nejednotné konce fragmentov – potreba enzymaticky modifikovať pred klonovaním do vektora
- Parciálnym štiepením:
ü Reštrikčný enzým s menej frekventovanými miestami, ktoré rozpoznajú a limitovať čas pôsobenia
ü Populácia väčších fragmentov DNA, ktoré sa prekrývajú
ü Fragmenty je možné selektovať na základe veľkosti po separácii na géloch
ü Fragmenty majú lepivé konce a dajú sa priamo klonovať do vektorov
Príklad: parciálne štiepenie so Sau3A, vytvorenie knižnice z prekrývajúcich sa fragmentov DNA rôznych dĺžok
cDNA knižnice:
1. cDNA je odvodená od mRNA, neobsahuje intróny
2. cDNA môže obsahovať menej informácií, ako celá kódujúca oblasť
3. cDNA knižnica odzrkadľuje aktivitu génov v bunke v danom čase
v Príprava cDNA knižníc:
Ø Izolácia mRNA:
ü Maturovaná eukaryotické mRNA má na 3 konci poly A chvost
ü Bunkový lyzát sa pretlačí kolónkou, v ktorej je matrica s pevne viazanými reťazcami oligo dTs (kyselina deoxithymidylová)
ü Poly A chvosty z mRNA sa prilepia k oligo dT a zachytia molekuly, všetko ostatné prejde kolónkou
ü mRNA sa vymyje a odchytáva
Ø Syntéza cDNA:
ü Oligo dT (TTTTTT) primer priľne k poly A chvostu mRNA
ü Reverzná transkriptáza k primeru dosyntetizuje zvyšok komplementárneho vlákna a vzniká hybrid mRNA – DNA
ü mRNA degradujeme pomocou Rnase H, ale malé fragmenty RNA zostanú intaktné a slúžia ako primer
ü DNA polymeráza I syntetizuje novú DNA z 5 konca k 3 koncu a odstráni primery
ü DNA ligáza pospája fragmenty DNA
ü Vznikne dvojvláknová kópia mRNA
Ø Klonovanie cDNA:
ü cDNA má tupé konce . treba ich upraviť na lepivé
ü na konce pripojíme adaptory pomocou T4 DNA ligázy
ü štiepime sekvencie linkerov a vytvárame cNA s lepivými koncami
ü Klonujeme fragmenty do vektora
ü Transformácia – knižnica
Skríring cDNA knižníc:
§ cDNA knižnice sa používajú na detekciu (sekvenáciou) génov, ktoré kódujú proteíny (cDNA dokážeme vytvoriť len pre gény, ktoré sa transkribujú)
§ na ich skríring môžeme použiť:
ü homológnu aj heterológnu próbu (sondu) z iných organizmov
ü syntetické oligonukleotidy (aj degenerované)
ü protilátky pre hľadaný proteín
Identifikovaná cDNA môže byť použitá na:
ü Z génovej knižnice možno vybrať klon, ktorý obsahuje špecifický inzert (gén) a:
§ Izoláciu a sekvenáciu génu pre proteín
§ Identifikáciu a porovnanie s homologickými sekvenciami z iných organizmov
§ Kvantifikáciu množstva mRNA, ktorá sa syntetizuje z daného génu m – meranie hladiny jeho expresie
§ Transformáciu iných organizmov (shuttle vektory)
§ namnožiť ho študovať jeho šruktúru alebo funkciu
§ sekvenovať ho
§ zostrojiť jeho reštrikčnú mapu
§ pomocou in situ hybridizácie zistiť jeho lokalizáciu na chromozóme
§ v expresnom vektore možno dosiahnuť expresiu génu do bielkoviny a skúmať vlastnosti, biologickú aktivitu, funkciu
§ gén možno in vitro modifikovať - vyvolať špecifické mutácie a študovať dôsledky takýchto riadených mutácii - in vitro riadená mutagenéza vzťah medzi štruktúrou a funkciou mnohých génov, regulačných oblasti a pod.
§ klonovaný gén možno využiť pre biotechnologickú výrobu génového produktu (inzulín, interferón, rastový hormón, vakcíny a pod.).
Knižnice DNA slúžia na:
ü Ako katalógy
ü Na dlhodobé uchovávanie
ü Ako východiskový materiál pre ďalšie analýzy
DNA čipy:
ü Technika DNA čipov umožňuje analýzy a porovnávanie celých genómov
ü Státisíce rôznych fragmentov DNA (cDNA, PCR fragmenty) sú prichytené na chemicky opracované sklíčko, a môžu byť naraz hybridizované k dvom rôznym vzorkám RNA, napríklad z kontrolnej a stresovanej rastliny
ü V tomto prípade sú vzorky z kontrolnej resp. stresovanej rastliny označené rozdielnymi fluorescenčnými farbičkami (červenou a zelenou)
ü Po hybridizácii a nasnímaní sklíčka sa detekujú gény, ktoré sa exprimujú len v kontrolnej rastline (červené hybridizačné body), len v stresovanej rastline (zelené hybridizačné body) alebo v oboch typoch rastlín (žlté hybridizačné body ako výsledok prekrytia zelenej a červenej fluorescencie oboch vzoriek)
ü Technika je veľmi finančne náročná, uplatňuje sa v lekárskej diagnostike, analýze stresových reakcií, genomike a podobne
